单细胞测序技术发展|原理|应用-生信自学网

一、单细胞测序技术的发展
早在 l9 世纪，部分学者通过显微镜就已经发现，即使是同一组织也是由一些形态特征不同的细胞构成的。越来越多的研究表明，机体内每个细胞，即使是相同组织来源的细胞，彼此之间的基因组、表观基因组和转录组都会有些许差异。由于细胞异质性的存在，以往对由各种各样不同的细胞混合而成的组织进行测序时，其分析结果会掩盖各种不同细胞之间在功能上和基因组的差异和改变。因此，基于单细胞水平上的研究就显得日益重要。单细胞测序技术是指在单个细胞水平上面对转录组或基因组进行扩增并测序，以检测单细胞基因组结构变异、基因拷贝数变异(Copy number variants，CNVs)、单核苷酸变异(Single nucleotide variants，SNVs)、基因融合、基因表达水平、单细胞转录组选择性的剪接、单细胞基因组的 DNA 甲基化状态等。

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近几年来，单细胞测序技术发展迅速，与传统测序方法相比起来，其对解决生物材料的低获取量和生物异质性等问题尤为重要。凭借这一技术，研究者们可在单细胞水平上面研究生物进程和一些疾病的发生发展，包括肿瘤进化和癌变，循环肿瘤细胞(Circulating tumor cells，CTCs)、早期胚胎发育、神经细胞基因组异质性和不可培养的微生物等，而研究成果也在一定程度上颠覆了人们对这些生物现象的根本认识。总体上讲，单细胞测序技术可分为单细胞基因组测序和单细胞转录组测序。单细胞基因组测序是研究整体基因的基因突变情况，包括基因插入和缺失、单核苷酸变异等。单细胞转录组测序一般针对的是细胞的调控基因，尤其是针对像早期胚胎细胞和肿瘤干细胞这类具有高度异质性的细胞群体而言。单细胞转录组测序有助于分析细胞的细胞分化、基因重组、基因调控网络等过程。此外，单细胞转录组测序通过更精准的检测率来显示一些和转录相关的分子改变，如微小 RNA、信使 RNA、长链非编码 RNA、内含子保留、融合基因、选择性剪接等。单细胞转录组测序技术在技术层面需要克服很多困难，主要包括：起始 RNA 含量较少，通常只有 10Pg 左右；无法保证绝大部分 mRNA 都被逆转录生成 c DNA ；无法高效准确地得到全长 c DNA，而不是靠近位于 poly A 尾的断裂的 c DNA。Picelli等和 Ramskold 等提出了一种命名为 Smart-Seq 的新的单细胞转录组测序方法，该方法较以往的方法相比起来具有更高的准确性和敏感性，从而大大地提高了转录基因的的读序覆盖度和准确度以及对基因多态性的识别能力。

二、单细胞测序技术的原理
单细胞测序主要包括单细胞基因组测序和转录组测序，通过对单个细胞内的ＤＮＡ和ＲＮＡ进行序列分析，分别揭示单个细胞的基因组和转录组的变化情况。单细胞全基因组测序是对选定的目的细胞的全部基因组序列进行非选择性、均匀扩增，随后利用外显子捕获技术进而高通量测序。单细胞转录组测序是利用高通量测序技术进行ｃＤＮＡ测序，从而获取特定器官或组织在某一状态下的几乎所有转录本，主要用于在全基因组范围内挖掘基因调节网络，尤其适用于存在高度异质性的干细胞及胚胎发育早期的细胞群体。与活细胞成像系统相结合，单细胞转录组分析更有助于深入理解细胞分化、细胞重编程及转分化等过程及相关的基因调节网络。

三、单细胞测序技术在肿瘤基础研究中的应用
随着人类基因组计划（ｈｕｍａｎ　ｇｅｎｏｍｅ　ｐｒｏｊｅｃｔ，ＨＧＰ）和国际人类基因组单体型图计划（ｔｈｅ　ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ＨａｐＭａｐ　ｐｒｏｊｅｃｔ）的完成以及高通量生物芯片技术的成功研发，以全基因组测序为目标的基因组结构初步分析已经完成。研究发现，肿瘤是在细胞水平的恶性克隆，同时，恶性肿瘤细胞通过对自身的不断的“改良”以适应宿主各种环境。从进化上来说，能够引发恶性肿瘤的细胞即所谓“成功”的肿瘤细胞，其具备将遗传模板传递给下一代肿瘤细胞的能力，而能够引致远处转移的恶性肿瘤细胞其自身必定带有其他肿瘤细胞亚群所不具备的信息。因此，在单克隆水平去分析这些肿瘤克隆的发生、发展、转移等，有可能揭示恶性肿瘤产生的具体机制。由于恶性肿瘤本身的异质性，在原发灶的肿瘤细胞群可能是由具备血管生成、侵袭能力、转移特性等不同方面的能力或是具备多功能的细胞亚群所组成。目前普遍认为，倾向于发生远处转移的一些细胞亚群在亲代肿瘤中已然存在，不同的转移灶可从不同的单个细胞增生而来，并且这些发生转移的细胞亚群受多重机制的调控。如果能够以单个细胞进行整个全基因组范围的分析，不仅取材更经济，更重要的是细胞可能达到真正的纯化，实验所得结果更精确也更可靠。因此，探索单个肿瘤细胞的遗传信息并对其进行分析成为肿瘤基础研究人员的梦想。

２０１１年，由纽约冷泉港实验室、德州大学安德森癌症研究中心开发并报道单细胞测序技术（ｓｉｎｇｌｅ　ｃｅｌｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ＳＮＳ），该技术能够突破传统癌症基因组研究的如混合样品测序无法判断具体突变来源及频率，无法解释癌症的发生、发展以及演化过程中的细节，难以区分主动与被动突变；细胞系测序无法除去体外培养时产生的新突变等问题。目前，对于恶性肿瘤单细胞测序已应用于神经胶质瘤、肾癌、血液肿瘤等恶性肿瘤的发病机制等的研究，同时，也有研究者将该技术应用于乳腺癌转移机制方面的研究。将单细胞的纯化技术联合单细胞测序技术应用于肿瘤的相关机制研究必将能够取得突破性进展。

四、单细胞RNA-Seq在临床中的应用
随着单细胞测序在肿瘤研究领域取得了骄人的成果，人们开始探索如何能把这项技术与临床相结合，解决一些实际问题，给肿瘤患者带来益处。在肿瘤的诊断、转移早期监测、个体化治疗等方面已有初步的尝试。
1、肿瘤的早期诊断
在临床上，癌症早期患者病灶处往往只有少量的肿瘤细胞，因而难以诊断，常常会因为误诊、漏诊而错过最佳的治疗时机，加快病情发展。在低级别的乳腺原位癌患者中，仅有5%~10% 会突破基底层而更具有侵袭性。Allred 等的研究表明，在乳腺癌的早期，个别肿瘤细胞确实会具有特殊的基因特征。因此，如果能利用从原位癌患者体内少量肿瘤细胞提取的DNA 或RNA 的信息，通过单细胞测序技术而检测出是否含有那些具有高度侵袭性的肿瘤干细胞，就可以此对肿瘤的恶性程度做出判断，及时地调整治疗策略。通过对抽血或细针穿刺等微创方式获得的样本进行转录组分析，可以使患者得到快速的即时诊断(point-of-care diagnostic)。

2、利用循环肿瘤细胞监测恶性肿瘤的转移
单细胞测序的另一个主要的应用方向就是通过对循环肿瘤细胞进行基因分析来达到监测肿瘤转移的目的，使医生能尽早地做出临床干预来控制肿瘤转移的发生。循环肿瘤细胞是指少量侵袭力强能够突破原发灶释放到循环系统中的肿瘤细胞，这类细胞非常稀少，估计与血细胞的比例为1:10 000 万。尽管比例很低，但是还是可以通过一些特殊的表型分子标记来识别，这类标记分子往往与上皮- 间叶组织化生这一肿瘤转移的特征性病理过程有关。早年间通过对化疗后转移到骨髓的肿瘤单细胞进行转录组微阵列分析就已经发现，细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(extracellular matrix metalloproteinase,EMMPRIN/CD147) 与肿瘤的侵袭性和化疗抵抗性相关。对黑素瘤患者的CTC 进行RNA-Seq 发现，多种膜蛋白基因的异常表达与CTC 的侵袭性和逃避机体免疫监视的能力有关，研究者采用SMARTSeq 方案获得了近乎全长的转录组，由此来寻找黑素瘤患者的CTC 存在哪些转录组单核苷酸多态性
(single nucleotide polymorphism, SNP) 可以有助于对肿瘤的监测。Cristofanilli 等[41] 已证明了检测CTCs能提示转移性乳腺癌患者的预后和对治疗的反应。在趋势抵抗性前列腺癌患者中，通过免疫磁珠富集测试CTC 水平比前列腺特异抗原PSA 对整体生存率有更好的预测作用。对CTCs 进行单细胞测序主要具有两大应用价值。首先，比肿物活检能得到纯度更高的肿瘤细胞，且相比腹膜后淋巴结活检大大简化了操作过程；其次，对样本质量的要求更低，无论是体积仅7.5 mL的血液还是穿刺液，都能够对所含有的微量DNA或RNA 信息做出精确分析。

3、肿瘤异质性指导个体化治疗
忽略肿瘤异质性是导致肿瘤治疗效果不佳的潜在因素，会影响到患者的预后。如何将单细胞测序得到的肿瘤异质性信息运用到肿瘤的个体化药物治疗上成为目前研究的一个趋势。Navin 等通过单细胞测序分析了2 例原发乳腺癌患者基因拷贝数变异，其中一例是单基因性，另一例是多基因性的，分为3 个不同的克隆亚群。Gerlinger 等发现了肿瘤存在多基因重建，63%~69% 的体细胞突变往往不能被探测到。Powell 等的研究表明，根据不同的基因表达类型可以将乳腺癌患者的CTCs 分为5 个亚群，以往组织活检并不能反应单个癌细胞的基因表达情况，根据CTCs 不同的基因类型来制定治疗策略显得尤为重要。这些研究结果都提示：组成肿瘤的不同细胞都有不同的基因学改变，这些改变无法通过对肿瘤整体的检测来发现，而且这些基因异质性有可能是导致治疗失败的原因。因此，对肿瘤患者进行单细胞测序有助于发现一些稀有的和耐药性相关的基因，以加强用药的针对性。Dalerba 等建立了一套基于检测几种关键基因进行多变量分析计算危害比来预测结肠癌临床预后的系统，预测效果要优于以往的病理分级制度，临床医生可以根据这套系统来判断患者预后，以便及时制定或调整治疗方案。