单细胞转录组测序的常用方法
时间:2020-02-02 来源:生信自学网 作者:乐伟
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单细胞测序一直是科学家关注的一个热点，主要涉及单细胞基因组测序和转录组测序两个方面，分别针对单细胞DNA及RNA进行序列分析和比较。单细胞转录组测序(Single-cell RNA-sequencing, scRNA-seq)是在单个细胞水平对mRNA进行高通量测序的一项新技术，原理是将分离的单个细胞中微量的mRNA通过扩增后再进行高通量测序。单细胞转录组测序能够有效解决组织样本细胞异质性以及常规RNA-seq被掩盖的细胞群内的转录组异质性难题，有助于发现新的稀有细胞类型，并深入了解细胞生长过程中的表达调控机制。 单细胞基因组测序目前主要有两种扩增方法：MALBAC方法及MDA方法，而单细胞转录组目前主要有三种方法：SMART扩增技术、10×genomics技术及Andeplete技术。今天主要和大家比较下单细胞转录组测序的三种常用方法。 一、SMART扩增技术： SMART技术的出现是一个新的里程碑。这个称作Switching Mechanism At 5’ end of the RNA Transcript(SMART)，原理实际上非常简单：在合成cDNA的反应中事先加入的3’末端带Oligo（dG）的SMART引物，由于逆转录酶以mRNA为模板合成cDNA，在到达mRNA的5’末端时碰到真核mRNA特有的“帽子结构”，即甲基化的G时会连续在合成的cDNA末端加上几个（dC），SMART引物的Oligo（dG）与合成cDNA末端突出的几个C配对后形成cDNA的延伸模板，逆转录酶会自动转换模板，以SMART引物作为延伸模板继续延伸cDNA单链直到引物的末端，这样得到的所有cDNA单链的一端有含Oligo（dT）的起始引物序列，另一端有已知的SMART引物序列，合成第二链后可以利用通用引物进行扩增。由于有5’帽子结构的mRNA才能利用这个反应得到能扩增的cDNA，因此扩增得到的cDNA就是全长cDNA。 这个专利的方法是利用逆转录酶内源的末端转移酶活性，只要单管，一步即可完成，不需要额外的cDNA抽提纯化或者沉淀，或者额外的酶反应，只需要少至25ng的mRNA或者50ng的Total RNA就可以得到高质量、高产量的cDNA库，更重要的是得到的cDNA能够代表原有样品中的mRNA的丰度，可以应用于直接扩增基因、构建cDNA文库、已知序列钓全长cDNA（RACE），和用于芯片检测的cDNA探针的扩增等。 通过SMART技术得到的主要是mRNA信息，LncRNA信息大部分会丢失，SMART技术对于RNA的质量要求较高，如果RNA出现降解会导致mRNA 5’端信息丢失。通用引物技术能保证扩增的均一性，但PCR引入的突变不能够分析出来。 二、10×genomics技术： 作为单细胞测序的另一个重要里程碑，10x genomic公司于2016年2月推出10x Chromium Single Cell Gene Expression Solution，此平台整合了仪器、试剂盒和信息学软件，能全面对接illumina测序仪，因此可实现大量大细胞的快速高效标记、测序和分析，获得单细胞水平的基因表达谱和差异情况，并通过对复杂细胞群体进行深入细致分析，绘制大规模单细胞表达图谱。 介绍10X Genomics技术流程前，首先介绍Gel bead（凝胶磁珠）。Gel bead由凝胶珠和磁珠上的一段引物构成，首先在凝胶微珠上种上特定的DNA片段，DNA片段由三部分组成：Barcode、UMI、PolyT组成。Barcode是16个碱基的长度。一共有400万种Barcode，一个微珠是对应于一种Barcode，通过这400万种Barcode，可以把凝胶微珠给区分开。UMI是一段随机序列，也就是说每一个DNA分子，都有自己的UMI序列。10个碱基长的UMI，有100万种序列的变化（4^10 = 1,048,576），UMI的作用是为了区分哪些哪些reads是来自于一个原始cDNA分子，区分基因片段重复还是duplication及区分是真实的SNP位点还是PCR产生的突变。 Gel bead结构  通过10×genomics仪器将单个细胞与单个凝胶微珠通过油相混在一起，形成油包水的小微滴，接下来把细胞膜破掉，让细胞当中的mRNA游离出来。游离出来的mRNA与小液滴中的水相混合，也就是和逆转录酶、结合在凝胶微珠上的核酸引物、以及dNTP底物相接触。 接着，发生逆转录反应。mRNA与凝胶微珠上带标签的DNA分子相结合，在逆转录酶的作用下，逆转录出cDNA来。把这个乳浊液当中所有的水相抽出来，也就是把所有带了标签的cDNA分子都抽出来，再把这些cDNA分子都加上接头，经过PCR扩增，做成illumina的测序文库，放到Illumina的测序仪上进行测序。测序完成之后，进行数据分析。 10×genomics技术一次可以同时得到大量大细胞数据，但只能得到mRNA信息，LncRNA大部分信息丢失，UMI技术能很好去除认为分析引入duplication及PCR引入SNP位点。同样对RNA质量要求高，降解同样会引起5’端信息丢失。 三、Anydeplete 技术  Anydeplete技术首先通过随机引物进行一链合成，一链合成引入核苷酸类似物，用于酶切打断，二链合成同样引入核苷酸类似物用于保证链特异性。然后两端加上接头，接头一条链也带有核苷酸类似物，用于酶切降解。当形成单链文库后，设计特异性引物与rRNA形成文库结合，一轮退火延伸，rRNA文库形成双链结构。Reverse adaptor上带有特异的酶切位点，当形成双链结构酶切位点被识别，切去接头，这样rRNA形成的文库不带有完整的接头，而其他文库带有完整接头，通过PCR扩增富积既能得到想要的信息，包含mRNA及LncRNA信息。同样Anydeplete技术与10×genomics技术一样，包含分子标签，可分析duplication及PCR产生突变位点。 Anydeplete技术能够用于降解性样本，保证5’端及3’端信息的完整，能同时得到mRNA及LncRNA信息，如果只希望得到mRNA信息，Anydeplete技术则会引起一部分数据浪费。 应用和优势对比：  SMART技术可用于单细胞mRNA测序，对RNA质量要求高，RNA降解会引起5’端信息丢失，没有分子标签功能。 10×genomics技术可用于单细胞mRNA测序，对RNA质量要求高，RNA降解会引起5’端信息丢失，有分子标签功能。 Anydeplete技术可用于单细胞mRNA及LncRNA测序，对RNA质量要求不高，可用于降解性样本测序，有分子标签功能。 生信自学网精品课程推荐： 《GEO数据库单细胞测序分析》 《中药复方网络药理学》 《TCGA数据库单基因挖掘套路》 (责任编辑：伏泽 微信：18520221056) 
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