高通量测序数据发文思路
时间:2017-08-15 来源:原创 作者:森莘
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| 随着高通量检测（基因芯片/二代测序）价格的降低，全基因组检测也成为较为常规的实验之一。然而面对动辄几万个基因的高通量数据，后期的数据分析显得尤为重要。 一、基础分析 1、聚类分析 说到聚类分析，想必大家不会陌生，几乎所有做过芯片和测序的文章中，都要放几张聚类分析的图。聚类分析有各种各样类型，主要是由Cluster TreeView，和R语言 pheatmap包生成的。  为了全面直观的展示样品之间的关系及差异情况，将差异表达基因做无监督层次聚类分析（Hierarchical Clustering），以热图（heatmap）形式显示。用挑选的差异基因的表达情况来计算样品之间的相关性，同一类样品能通过聚类出现在同一个簇中，且聚在同一个簇的基因可能具有类似的生物学功能。  2、散点图（Scatter Plot） 芯片或测序数据经过标准化处理后，在一个二维直角坐标系平面中，绘制散点图。芯片数据的散点图常用于评估两组数据总体分布集中情况。散点图中每一个点代表芯片上的探针点，该点在二维平面中的位置根据其在不同组中的表达量，由X轴和Y轴坐标确定  3、火山图（Volcano plot） 芯片或测序数据经T-Test分析得到P-value值与FC值，两个因素共同绘制火山图（Volcano Plot），用于显示两组样数据的显著性差异。横轴代表探针的差异显著程度（-log10 P-value），纵轴代表探针的差异倍数（Fold chang）  4、主成份分析 PCA PCA 分析，即主成分分析，是一种对数据进行简化分析的技术，这种方法可以有效的找出数据中最“主要”的元素和结构，去除噪音和冗余，将原有的复杂数据降维，揭示隐藏在复杂数据背后的简单结构。它的优点是简单，而且无参数限制，可以方便的应用于各个场合。坐标轴取能够最大反映方差值的三个特征值。  二、Pathway富集分析 如果做完高通量检测后只能做1种分析，那么Pathway分析是最好的选择。 目前，KEGG是有关Pathway的主要数据库。通过计算差异基因和Pathway 的超几何分布关系，每个有差异的Pathway 返回一个p-value，较小的p 值表示较高的富集程度。简单来说，P值越小，这个Pathway越重要。 Pathway分析看似基础，却有一些需要注意的地方 第一：数据库版本 KOBAS3.0 第二：结果展示形式 最简单的展示形式就是直接放个Excel表格，按照Pathway的P值做一下排序  稍微高级一点点的方法是用Pathway的-lgP来展示Pathway显著性  找到某几个P值较小或自己比较感兴趣的信号通路  用cytoscape做全局信号转导网络  三、ceRNA网络 如果左手有一组MicroRNA数据 右手有一组mRNA/lncRNA数据 如何利用多组数据 找到核心MicroRNA和重要靶基因 如何分析最近正热门的CeRNA关系 1、靶基因预测 用倍数法或P值筛选到差异MicroRNA后，第一步要做的就是靶基因预测，靶基因预测数据库很多，常见的有这些： Targetscan  miRDB  2、相关性分析 靶基因预测结果通常很多，一个MicroRNA对应上千个mRNA的情况很常见，如何减少假阳性率，是靶基因预测的关键，推荐两种方法： 1. 多个数据库取交集，通常用2~3个数据库的共同结果，优点是可以有效减少靶基因数量，缺点是不同数据库算法不同，有时可能取不到靶基因。 2. 用单一数据库预测结果和mRNA高通量检测结果取交集，找到既受MicroRNA调控又有相应表达变化的靶基因（负相关）。 3、MicroRNA-Gene调控网络构建 如何在几十个MicroRNA和几千个靶基因中挑选出最重要的调控因子，供下游研究，是MicroRNA分析的难点。 这就需要咱们来构建一个MicroRNA-靶基因调控网络。 首先确定网络中的元素：MicroRNA当然就是用差异MicroRNA，但是靶基因太多，为了避免网络太复杂，变成这样  我们关键问题是如何提剔除冗余mRNA 推荐在构建网络之前先对靶基因进行GO和Pathway富集，选择有显著性（P<0.05）的GO和Pathway中的基因构建网络。 这样可以有效减少靶基因数量。 构建一个正常的调控网络  然后，利用网络中的特征值 特征值最高的MicroRNA处于网络的枢纽性地位 该MicroRNA调控能力最强 同时找到被MicroRNA调控的关键靶基因 4、CeRNA分析 CeRNA（competing endogenous RNAs）假说揭示了一种RNA间相互作用的新机制。 已知MicroRNA可以通过结合mRNA导致基因沉默，而ceRNA可以通过竞争性地结合MicroRNA来调节基因表达。ceRNA可以通过应答元件（microRNA response elements，MREs)与microRNA结合从而影响microRNA导致的基因沉默，这揭示了一条RNA→microRNA调节通路的存在，具有重大生物意义。 目前，环状RNA（circRNA）研究很热，但事实上circRNA只占ceRNA的一小部分：  以lncRNA为例（也可以是mRNA/circRNA等）展示一下如何筛选CeRNA关系，构建CeRNA调控网络：  寻找mRNA和lncRNA共同结合的MicroRNA：  找到与同一个MicorRNA作用的一对mRNA和lncRNA，LncRNA在这里起到竞争性结合作用，充当MicroRNA海绵。 剔除冗余CeRNA关系：因为虽然很多mRNA和lncRNA都和同一个MicroRNA有配对关系，但他们在体内没有竞争关系，这种lncRNA并不作为有效的CeRNA，需要在分析中剔除。 方法为通过Co-expression 算法，筛选有正相关关系的mRNA-lncRNA组合。 这样，就找到了准确的CeRNA关系。再把这些关系放进网络中，就可以构建出CeRNA作用网络：  推荐一篇CeRNA的经典文献（关注微信公众号、加QQ可获得论文） “A Long Noncoding RNA Activated by TGF-β Promotes the Invasion-Metastasis Cascade in Hepatocellular Carcinoma”  (责任编辑：伏泽 微信：18520221056) 
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